Principaux produits tampons

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Principaux produits tampons

Message par Erwinia le Lun 27 Déc - 18:40

Les produits tampons doivent être choisis avec soin. Ils devraient combiner le plus des caractéristiques souhaitables. Tout d'abord leur pK devrait ëtre le plus près possible du pH qu'on veut maintenir. Sa capacité tampon devrait être la plus forte possible, pour que son efficacité soit maximale. Si l'expérimentation ou la fabrication le requièrent, le produit devrait avoir un ΔpH/°C le plus faible possible. Évidemment, le tampon ne devrait pas inhiber ou perturber les phénomènes biologiques étudiés. Idéalement le tampon devrait être insoluble dans la membrane, donc incapable d'entrer dans les cellules. De plus, si la procédure exige des mesures spectrométriques, le tampon ne devrait pas absorber dans le visible ou l'ultra-violet. Enfin, une éventuelle réaction avec des composantes du milieu doit aussi être évitée: précipitation, chélation d'ions, etc.
Le "tris" (tris(hydroxymétyl)aminométhane) est un des tampons les plus couramment employés en biochimie. Son utilisation remonte assez loin dans le temps. C'est un produit synthétique facilement disponible commercialement, en plus d'être peu coûteux comparé à de nombreux autres. Il est aussi disponible sous forme non dissociée (base) et dissociée (sel de Cl-) ce qui facilite la fabrication de solutions de pH voulu. Il possède cependant de très nombreux inconvénients qu'il est bon de connaître. Ainsi son pK à 20°C est de 8.30. À pH 7.4, un pH couramment utilisé expérimentalement, il est donc à l'extrême limite de sa zone d'efficacité. Son principal défaut cependant est qu'il est très sensible à la température et à la concentration. Par exemple, une solution de 0.1 M de pH 7.8 à 20°C descendra à 7.4 à 37°C et montera à 8.4 à 4°C. De plus, il inhibe plusieurs phénomènes biologiques en plus d'être très soluble dans les membranes, donc susceptible de s'infiltrer dans les cellules et les organites. Enfin sa capacité de chelater fortement certains ions métalliques le rendent nuisible dans certains types d'expériences. Cependant il est abondamment utililisé autant pour la confection de milieux "physiologiques" que comme tampon dans des systèmes électrophorétiques ou autres. Son emploi malgré ses nombreux défauts a même été qualifié de comportement "moutonnier" ("herd mentality") (Constans, 2004)
Le système bicarbonate-CO2 tente de reproduire le principal système tampon du sang. Son inconvénient principal est qu'il doit être utilisé sous atmosphère de 5% de CO2, exigeant des dispositifs spéciaux d'incubation. De plus, son pK de 6.1 le rend peu efficace à pH 7.4. Malgré toutes ces faiblesses, il est abondamment utilisé dans les cultures de cellules mammaliennes à cause de la base physiologique de sa présence.
Le phosphate, sel de Na ou de K, est souvent utilisé dans les solutions physiologiques comme le PBS ("phosphate buffered saline"), les solutions de Ringer, de Krebs-Henseleit, etc. En effet il est présent dans les cellules et le dang, même s'il n'y a qu'un rôle mineur dans le maintien du pH. Mais, même si son pK est de 7.2 (phosphate mono- et dibasique), sa capacité tampon (b) est faible, ce qui le rend plus ou moins efficace. Il a aussi tendance à faire précipiter certains ions divalents, comme le Mg2+ ou le Ca2+, les rendant moins disponibles pour leurs fonctions biologiques. Enfin, il inhibe plusieurs enzymes ayant le phosphate comme produit réactionnel, en particulier la phosphatase alcaline.
Les tampons carboxyliques (citrate, succinate, acétate, etc.) ont aussi employés quelques fois. Comme ce sont des métabolites impliqués dans plusieurs voies, on ne devrait pas les utiliser s'ils risquent d'interférer sur le métabolisme étudié. Certains d'entre eux. comme le citrate et le succinate, sont des chelatants assez forts de certains ions divalents, particulièrement le Ca2+ et le Mg2+.
Les tampons zwiterioniques (ou tampons de Good) ont été développés par Good et ses collaborateurs. Ils comprennent une vingtaine de produits synthétiques, comprenant l'hepes, le pipes, aces, etc. Le but de leur développement était de trouver des produits le plus appropriés possibles aux applications biologiques: résistance aux dilutions et aux changements de température, peu d'effets inhibiteurs sur les processus biologiques, peu d'absorption dans le visible ou l'ultraviolet rapproché, insoluble dans les membranes, pas d'effet chelatant majeur, etc. Ils représentent une gamme de produits ayant une gamme de pK de 6 à 8. Un d'entre eux, l'hepes, a un pK de 7.6, ce qui lui donne une efficacité réelle dans la zone des pH physiologiques. Certains tampons zwiterioniques, mais pas tous, produisent des radicaux libres (Grady et al, 1988). Il convient donc de les utiliser prudemment dans l'étude des phénomènes impliquant des mécanismes redox ou l'étude de phénomènes liés de près ou de loin au stress oxydatif. Un autre problème, quoique mineur comparé au tris ou à certains tampons carboxyliques, est leur capacité de chelater certains ions métalliques. Quand cette caractéristique est problématique, on utilise des dérivés de ces tampons ayant un groupement éthyle sur l'amine tertiaire, ce qui annule leur effet chelatant (Yu et al, 1997).


Certains tampons sont volatils (bicarbonate, ammonium, formate) et peuvent être avantageux si on doit lyophiliser la préparation. En effet ils se subliment sous forme de CO2, NH3, etc., au lieu de se concentrer au fur et à mesure de la sublimation de l'eau. On sait que certaines protéines sont instables en présence de fortes concentrations de sels qui se forment souvent lors de la lyophilisation
Pour ce qui est de l'électrophorèse, les tampons à base d'acétate sont particulièrement efficaces (Brody et Kern, 2003).

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